15 Noviembre 2018
Preparación de medios de cultivo
-Objetivo:
Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el desarrollo de los microorganismos in vitro.
-Fundamento:
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente.
-Materiales:
->Vidrio de reloj
->Espátula
->Balanza
->Autoclave
->Papel de filtro
->Tubos
->Placas de petri
->Agar nutritivo y TSB
->Microondas
->Gradillas
->Botes de cristal
->Mechero bunsen
->Guantes térmicos
->Tapones para los tubos
->Agua destilada
->Probeta
-Procedimiento:
1- Preparar el agar-agar. Pesar la agarosa y medir el volumen de agua destilada en probeta. Lo introducimos en un bote de cristal.
2- Disolver la disolución de agar (girando cuidadosamente el bote) y calentar en el microondas.
3- Llenar los tubos con el gel de agarosa. Medio líquido.
(TSB-5ml en cada tubo/ Agar nutritivo 10 ml en cada tubo).
4-Esterilizar los tubos y los botes de cristal (el agar de estos botes es el que echaremos en las placas de petri) en la autoclave.
5-Dejar secar a temperatura ambiente. Dejamos los tubos de agar nutritivo inclinados para que solidifiquen (Slant).
6- Llenamos las placas de petri con ayuda de un mechero bunsen para crear un ambiente estéril.
7-Dejamos las placas un poco abiertas alrededor del mechero para que se solidifiquen y no formen vapor.
8- Limpiar la zona de trabajo con legía y alcohol.
-Resultados:
Para pesar el agar: (Nuestra mesa hizo el agar nutritivo 10ml tubo)
40g en 1L
1000ml......................40g
300ml......................xg x=12g de agarosa
-Composición y uso de los reactivos utilizados:
-Agar nutritivo:
Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento y recuento de microorganismos con escasos requerimientos nutricionales. Su uso está descripto para el análisis de alimentos, aguas...
El agar nutritivo contiene normalmente:
0,5% de peptona0,3% de extracto de carne/extracto de levadura 1,5% de agar 0,5% de cloruro de sodio agua destilada pH casi neutro (6,8) a 25 ºC
-TSB (Caldo Triptona Soja):
- Triptona de caseína 17.00 g
- Peptona de soja 3.00 g
- Cloruro sódico 5.00 g
- Fosfato dipotásico 2.50 g
- Glucosa 2.50 g
- Extracto de Levadura 6.00 g
Medio adecuado para de microorganismos exigentes. Es utilizado en el control de esterilidad de productos biológicos, farmacéuticos y cosméticos.
-TSA (Agar Soja Tríptico):
-Usos:
El Agar de Soja Tríptico (TSA, Tryptic Soy Agar) es usado para el cultivo de una amplia variedad de microorganismos.
El Trypticasein Soy Agar (TSA), se utiliza en una gran variedad de procedimientos no clínicos. En los procedimientos de análisis a nivel industrial es un medio muy utilizado. Los aislamientos obtenidos en este medio deben estar sujetos a posteriores trabajos de identificación. Se puede utilizar en el cultivo de las bacterias menos exigentes, Enterobacterias, Pseudomonas, Enterococcus, Staphylococccus, Bacillus y otros microorganismos con similares requerimientos de crecimiento El TSA no contiene componentes que neutralicen los desinfectantes o conservadores, si la muestra los contuvieran se recomienda el uso de TSA con Lecitina y Polisorbato.
-Composición:
Hidrolizado pancreático de caseína 15.0 g
Hidrolizado papaínico de harina de soja 5.0 g
Cloruro sódico 5.0 g Agar 15.0 g
pH : 7,3+/- 0,2
-Agar EMB.
-Uso: es un medio ligeramente selectivo y de diferenciación para el aislamiento y la diferenciación de bacilos gram negativos entéricos (Enterobacteriaceae y diversos otros bacilos gram negativos) a partir de muestras clínicas.
-Composición:
Digerido pancreático de gelatina 10,0 g
Lactosa 5,0
Sacarosa 5,0
Fosfato dipotásico 2,0
Agar 13,5
Eosina 0,4
Azul de metileno 0,065
pH 7,2 +/- 0,2
*Ajustada o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento.
-Agar MacConkey.
-Uso: es un medio de diferenciación selectivo para el aislamiento y la diferenciación de Enterobacterias y diversos otros bacilos gram negativos a partir de muestras clínicas.
-Composición:
Digerido pancreático de gelatina 17,0 g Digerido pancreático de caseína 1,5 gDigerido péptico de tejido animal 1,5 gLactosa 10,0 gSales biliares 1,5 gCloruro sódico 5,0 g Rojo neutro 0,03 gCristal violeta 0,001 gAgar 13,5 gpH 7,1 ± 0,2 * Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento.
-Citrato de Simmons.
-Uso: Simmons Citrate Agar, es un medio de cultivo utilizado para diferenciar las bacterias Gram negativas en función de su capacidad de utilizar el Citrato como única fuente de Carbono.
-Composición:
Citrato Sódico 2,0 g
Cloruro Sódico 5,0 g
Fosfato Amónico 1,0 g
Fosfato dipotásico 1,0 g
Sulfato Magnésico 0,2 g
Agar 15,0 g
Azul de Bromotimol 0,08 g
pH= 6,8 +/- 0,2
-KIA.
-Uso: Medio de diferenciación e identificación de bacilos entéricos Gram-negativos basándose en la fermentación de azúcares (glucosa y lactosa) y producción de Hidrógeno Sulfuro.
-Composición:
Composición (g/l):Amonio Hierro(III) Citrato: 0,5D(+)-Glucosa: 1,0Lactosa: 10,0Mezcla de Peptonas: 20,0 gRojo de Fenol: 0,025Sodio Cloruro: 5,0Sodio Tiosulfato: 0,5Agar: 15,0pH: 7,4±0,2
-Agar ORI.
-Uso: se utiliza para el aislamiento de bacterias comúnmente presentes en infecciones de las vías urinarias. Mientras que CHROMagar Orientation Medium es un medio no selectivo para el aislamiento, la identificación o la diferenciación de patógenos urinarios.
-Composición:
Cromopeptonas 16,1 g
Mezcla cromógena 1,3 g
Agar 15,0 g
pH 6,9 ± 0,2
-Agar CLED.
-Uso: es un medio de cultivo diferencial para aislar y contar las bacterias presentes en la orina. Favorece el crecimiento de los patógenos y contaminantes urinarios aunque, debido a la ausencia de electrolitos, impide la indebida proliferación de especies de Proteus.
-Composición:
Digerido pancreático de gelatina 4,0 g
Digerido pancreático de caseína 4,0g
Extracto de carne bovina 3,0 g
Lactosa 10,0g
L-cistina 0,128 g
Azul de bromotimol 0,02 g
Agar 15,0 g
pH 7,3 +/- 0,2
*Ajustada o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento.
-Agar Hektoen.
-Uso: es un medio moderadamente selectivo y de diferenciación para el aislamiento y el cultivo de microorganismos gram negativos entéricos, y especialmente para el aislamiento de especies de Shigella y Salmonella a partir de muestras fecales.
-Composición:
Digerido péptico de tejido animal 12,0 g Cloruro sódico 5,0 g Extracto de levadura 3,0 gTiosulfato sódico 5,0 g Sales biliares 9,0 gCitrato férrico de amonio 1,5 gLactosa 12,0 gAzul de bromotimol 0,065 g Sacarosa 12,0 g Fucsina ácida 0,1g Salicina 2,0g Agar 14,0g pH 7,6 +/- 0,2 *Ajustada o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento.
-Agar Mueller-Hinton.
-Uso: disponible en varios formatos de placa, se utiliza en el procedimiento de difusión en disco estandarizado para la determinación de la sensibilidad de cepas aisladas a partir de muestras clínicas de organismos aerobios de rápido crecimiento ante agentes antimicrobianos.
-Composición:
Extracto de carne bovina 2,0 g Hidrolizado ácido de caseína 17,5g Almidón 1,5 gAgar 17,0 g pH 7,3 +/- 0,2 *Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento.
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